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Descrição

Hot Start PCR Master Mix

Armazenar a -20ºC.

O PCR Master Mix Hot Start 2x permanence estável quando armazenado por 2 meses a 4ºC. Portanto, mantenha uma alíquota de uso frequente a 4ºC.

Descrição do 2X Hot Start PCR Master Mix

O PCR Master Mix Hot Start 2X é uma solução pronta para uso que contém Taq DNA Polimerase, anticorpo anti-Taq DNA polimerase, tampão de PCR, MgCl2, dNTPs e estabilizadores. É idealizado para aplicações da rotina de PCR, utilizando amostras de DNA, colônias de bactérias e cDNA. Este mix é capaz de amplificar fragmentos de até 5kb.

O anticorpo anti-DNA Taq polymerase inibe a atividade da enzima promovendo um “início automático” após a denaturação inicial. Esta inibição protege a degradação da enzima neste passo, maximizando a sua ação nos ciclos de amplificação, além de proteger a enzima em temperatura ambiente.

Devido a sua ligação específica ao anticorpo, o PCR Master Mix Hot Start 2X é normalmente inativo, sendo reativado depois do passo de desnaturação a 95°C.

O hot start mediado pelo anticorpo pode elevar a especificidade da reação de PCR e aumentar o rendimento dos fragmentos amplificados.

Protocolo
Este protocolo está otimizado para reações de volume final 50 μL. O volume final pode ser modificado.
Ao realizar várias reações ao mesmo tempo, sugerimos preparar um mix com os componentes comuns a todas as reações a serem preparadas a fim de reduzir erros de pipetagem.
1. Descongele o Master Mix PCR a temperature ambiente. Homogenize a solução descongelada e centrifugue rapidamente para que todo o conteúdo do tubo fique no fundo.
2. Sugerimos as seguintes quantidades para cada reação:

Componente Volume Conc. Final
PCR Master Mix Hot Start 2X 25 µL 1X
10 µM Primer Forward 1 µL 0.2 µM        (0.05–1 µM)
10 µM Primer Reverse 1 µL 0.2 µM       (0.05–1 µM)
Template variável < 1 μg
Água livre de Nuclease q.s.p 50 µL

Parâmetros recomendados para amplificação de PCR:

Stage Passo Temp Tempo
Hold Desnaturação inicial 95oC 2 min
Ciclos
(25 a 45 ciclos)
Desnaturação 95oC 30 seg
Anelamento 55oC
(Primer Tm)
30 seg
Extensão 72oC 60 seg por kb
Hold Extensão final 72oC 5 min

Orientações Gerais 
Template:
Use amostras de boa qualidade, purificadas, para aumentar o sucesso da amplificação. Recomendamos reações com quantidade final de 50 μl:
DNA Genômico                                          1 ng–1 μg
DNA Plasmidial ou Viral                            1 pg–1 ng
Primers:
Primers são sequências de 20–40 nucleotídeos de comprimento e idealmente tem quantidade de ligações GC de 40 a 60%. Programas de computador como Primer3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) pode ser utilizado para desenhar ou avaliar um primer. A concentração final ideal de cada primer numa reação deve ser 0.05–1 μM, tipicamente 0.1–0.5 μM.
Mg++ e aditivos: 
A concentração de Mg++ de 1.5–2.0 mM é ótima para a maioria das amplificações feitas com Taq DNA Polymerase. A concentração final de Mg++ no mix PCR Master Mix Hot Start 2X é 1.5 mM. Esta quantidade é satisfatória para a maioria dos amplicons. Entretanto a quantidade de Mg++ pode ser otimizada através de incremento de 0.5 ou 1.0 mM de MgCl2.
Em caso de amplificação de alvos mais difíceis, como sequências ricas em G-C, podem ser utilizados outros aditivos, como DMSO, betaina ou formamida. Veja informações adicionais sobre isso no link:
http://www.staff.uni-mainz.de/lieb/additiva.html
Desnaturação: 
Um passo de desnaturação inicial de 30 segundos a 95°C é suficiente para fragmentos de DNA ficarem no estado ideal para iniciar a amplificação. Em casos de amostras mais difíceis (maior quantidade de G-C), é necessário avaliar um ciclo mais demorado de desnaturação (2–5 minutos a 95°C) antes de iniciar a ciclagem da reação. Em casos de templates de provenientes de colônias, desnaturação inicial de 5 minutos a 95°C é recomendada.
Um passo de desnaturação de 15 a 30 segundos a 95°C é recomendado nos ciclos de PCR.

Anelamento: 
O passo de anelamento dura tipicamente entre 15 e 60 segundos. A temperatura utilizada é baseada no Tm do par de primers e gira em torno de 45 a 68°C. A temperatura de anelamento pode ser otimizada através de uma reação de gradiente de PCR, iniciando 5°C abaixo da temperatura calculada de melting do par de primers.

Extensão:
O passo de extensão é tipicamente feito na temperatura ótima de atividade da enzima Taq DNA polimerase: 72°C. Programe um minuto nesta temperatura para cada 1kb do tamanho do produto a ser amplificado nos ciclos de amplificação. Um passo final de extensão, depois de finalizados os ciclos de amplificação (geralmente 5 minutos a 72°C), é recomendado.

Número de Ciclos: 
Geralmente 25 a 35 ciclos rendem boa quantidade de produtos amplificados. Até 45 ciclos podem ser utilizados para detectar amostras com pouca quantidade inicial.
Produto de PCR: 
Os produtos de PCR gerados utilizando Taq DNA polimerase contém cauda poli A na região 3´. Por isso estes produtos podem ser ligados a vetores que contenham sequência poli T/U.

Ensaios de Controle de Qualidade
Ensaio Funcional: 
Mix PCR Master Mix Hot Start 2X é testado para amplificar uma região de 2kb do gene da beta-globina numa amostra de 50ng de DNA genômico humano. O resultado desta reação é visualizado em gel de agarose corado com brometo de etídeo.

Parâmetros de amplificação por PCR do gene da beta-globina:

Stage Passo Temp Tempo
Hold Desnaturação Inicial 95oC 2 min
30 ciclos Desnaturação 95oC 30 seg
Anelamento 55oC 15 seg
Extensão 72oC 60 seg
Hold Extensão Final 72oC 5 min

Primers utilizados para amplificar o gene da beta-globina humana:
2kb_Forward (5’ – TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC – 3’)
2kb_ Reverse (5’ – TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A – 3’)
Teste de atividade nuclease: 
Não foi detectada atividade endonuclease ou exonuclease.

 

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